Предисловие редактора перевода | 5 |
Предисловие | 7 |
|
ГЛАВА 1. Характеристика макромолекул | 11 |
|
Полипептидные и полинуклеотидные цепи | 14 |
Структуры полимеров | 16 |
Понятие о нативных и денатурированных структурах | 21 |
Линейные и циклические полинуклеотидные молекулы | 24 |
Поперечные связи | 25 |
Список литературы | 26 |
Задачи | 26 |
|
ЧАСТЬ I. Непосредственное наблюдение | 28 |
|
ГЛАВА 2. Оптическая микроскопия | 28 |
|
Основы теории микроскопии | 28 |
Устройство микроскопа | 33 |
Линзы объектива | 33 |
Окуляры | 35 |
Конденсорные линзы | 36 |
Регулировка микроскопа | 39 |
Контраст | 39 |
Метод тёмного поля | 40 |
Фазово-контрастная микроскопия | 42 |
Применение фазово-контрастной микроскопии | 45 |
Интерференционная микроскопия | 45 |
Поляризационная микроскопия | 46 |
Применение поляризационной микроскопии в биологии и биохимии | 50 |
Использование поляризационного микроскопа для измерения дихроизма | 52 |
Флуоресцентная микроскопия | 53 |
Приложение | 58 |
Регулировка фазово-контрастного микроскопа | 58 |
Список литературы | 58 |
Задачи | 59 |
|
ГЛАВА 3. Электронная микроскопия | 61 |
|
Принцип действия электронного микроскопа | 61 |
Методы приготовления образцов и получения контрастного изображения | 64 |
Получение образцов на подложке | 64 |
Подготовка образцов и увеличение контраста | 67 |
Специальные способы получения изображения | 82 |
Электронная микроскопия тёмного поля | 82 |
Микроскоп Крева | 84 |
Сканирующий микроскоп обратного рассеяния | 84 |
Список литературы | 86 |
Задачи | 87 |
|
ЧАСТЬ II. Общие лабораторные методы | 88 |
|
ГЛАВА 4. Измерение pH | 88 |
|
Осложнения при измерении pH | 91 |
Зависимость pH от концентрации ионов | 91 |
Загрязнение и нарушение показаний электродов | 92 |
Натриевая ошибка | 92 |
Проблема трис-буфера | 93 |
Типы электродов | 93 |
Использование индикаторной бумаги | 94 |
Избранная литература | 94 |
|
ГЛАВА 5. Введение радиоактивных меток и измерение |
радиоактивности | 95 |
|
Типы ядерных распадов, используемые в биохимии | 95 |
Бета-распад | 96 |
Распад с испусканием γ-лучей | 97 |
Свойства радиоактивного распада химических соединений | 97 |
Измерение β-радиоактивности методами, основанными на ионизации газов | 100 |
Измерение радиоактивности жидкостными сцинтилляционными счётчиками | 103 |
Процесс сцинтилляции | 105 |
Фоновый шум | 106 |
Тушение | 108 |
Пропорциональный счёт и анализ амплитуды импульсов | 109 |
Приготовление образцов | 112 |
Выбор растворителя, смешиваемого с водой | 114 |
Растворение образца | 115 |
Сорбция на мембранных фильтрах | 115 |
Определение эффективности счёта с помощью анализа амплитуды импульсов | 116 |
Регистрация γ-лучей | 120 |
Примеры использования радиоактивных препаратов | 122 |
Список литературы | 128 |
Задачи | 128 |
|
ГЛАВА 6. Авторадиография | 130 |
|
Ядерные эмульсии, используемые в биологических исследованиях | 130 |
Изотопы, обычно используемые в биологических и биохимических |
исследованиях | 133 |
Длина трека различных излучаемых частиц | 133 |
α-Частицы | 134 |
β-Частицы | 135 |
Взаимное расположение источника излучения и эмульсии | 137 |
Факторы, влияющие на выбор изотопа и соотношение эмиттер-эмульсия | 138 |
Разрешение | 138 |
Эффективность | 139 |
Фон | 140 |
Методики осуществления контакта между эмульсией и образцом | 141 |
Метод временного контакта | 141 |
Метод постоянного контакта | 142 |
Молекулярная авторадиография | 148 |
Авторадиография и электронная микроскопия | 151 |
Список литературы | 152 |
Задачи | 152 |
|
ГЛАВА 7. Мембранная фильтрация и диализ | 154 |
|
Фильтры из нитроцеллюлозы и мембранная фильтрация | 155 |
Фильтры из стекловолокна | 158 |
Фильтрация с использованием фильтров из нитроцеллюлозы и |
стекловолокна | 158 |
Осветление растворов | 158 |
Отделение осадков для измерения радиоактивности | 159 |
Замена среды для растущих бактерий | 159 |
Ннтроцеллюлозные фильтры и анализ связывания | 160 |
Различные приложения мембранных фильтров | 164 |
Диализ и молекулярная фильтрация | 165 |
Диализ через полые стеклянные волокна | 169 |
Список литературы | 170 |
Задачи | 171 |
. |
ЧАСТЬ III. Разделение и идентификация веществ | 172 |
|
ГЛАВА 8. Хроматография | 172 |
|
Распределительная хроматография | 173 |
Теоретические основы распределительной хроматографии | 173 |
Примеры распределительной хроматографии | 175 |
Адсорбционная хроматография | 176 |
Теоретические основы адсорбционной хроматографии 176 |
Виды адсорбционной хроматографии | 177 |
Работа колонки | 178 |
Хроматография на бумаге | 181 |
Экспериментальная методика хроматографии на бумаге | 182 |
Обнаружение и идентификация пятен | 184 |
Пептидные карты: специальное использование бумажной |
хроматографии при изучении белков | 184 |
Тонкослойная хроматография | 187 |
Газожидкостная хроматография | 190 |
Обнаружение веществ в элюате | 191 |
Идентификация компонентов по сигналам детектора | 193 |
Достоинства газожидкостной хроматографии | 195 |
Применение газожидкостной хроматографии | 195 |
Гель-проникающая хроматография | 196 |
Теоретические основы гель-проникающей хроматографии | 196 |
Материалы для гель-проникающей хроматографии | 197 |
Достоинства гель-проникающей хроматографии | 200 |
Приложения гель-проникающей хроматографии | 202 |
Тонкослойная гель-проникающая хроматография | 205 |
Приложения тонкослойной гель-проникающей хроматографии | 206 |
Ионообменная хроматография | 207 |
Свойства ионообменников | 207 |
Выбор ионообменника | 209 |
Выбор пористости и ситового размера | 210 |
Выбор pH, буферов и ионных условий | 211 |
Методика ионообменной хроматографии | 211 |
Приложения ионообменной хроматографии | 213 |
Специальные методики в хроматографии нуклеиновых кислот и белков, |
связывающихся с нуклеиновыми кислотами | 214 |
Хроматография на ДНК-целлюлозе | 214 |
Колонки с метилированным альбумином на кизельгуре (МАК) | 215 |
Колонки с гистонами на кизельгуре | 216 |
Хроматография на гидроксиапатите | 216 |
Аффинная хроматография | 217 |
Приложение | 219 |
Очистка фермента: пример использования многих хроматографических |
методик | 219 |
Список литературы | 220 |
Задачи | 221 |
|
ГЛАВА 9. Электрофорез | 223 |
|
Теория электрофореза | 223 |
Виды электрофореза | 224 |
Зональный электрофорез | 225 |
Непрерывный (поточный) электрофорез | 238 |
Изоэлектрическая фокусировка | 239 |
Препаративный электрофорез в больших масштабах | 243 |
Блок-электрофорез | 243 |
Электрофорез на колонках с полиакриламидом | 243 |
Иммуноэлектрофорез | 243 |
Список литературы | 245 |
Задачи | 246 |
|
ГЛАВА 10. Иммунологические методы | 247 |
|
Иммунологическая система | 247 |
Получение антител | 248 |
Реакция антигена с антителом | 249 |
Иммунные реакции, используемые в биологическом анализе | 250 |
Реакция преципитации | 250 |
Гель-диффузионные реакции преципитации и иммунодиффузия | 251 |
Фиксация комплемента | 253 |
Торможение фиксации комплемента и пассивная агглютинация | 256 |
Радиоиммунологический анализ | 257 |
Иммунорадиометрический анализ | 262 |
Примеры использования иммунологических методов в биологическом |
анализе | 263 |
Примеры использования радиоиммунологического анализа | 269 |
Иммунологические методики для локализации веществ в клетках, |
тканях и молекулах; флуоресцентные антитела и антитела, |
связанные с ферритином | 272 |
Список литературы | 272 |
Задачи | 273 |
. |
ЧАСТЬ IV. Гидродинамические методы | 275 |
|
ГЛАВА 11. Седиментация | 275 |
|
Основы теории скорости седиментации | 276 |
Оборудование для ультрацентрифугирования | 277 |
Распределение концентрации в эксперименте по скоростной седиментации |
в секторной ячейке | 283 |
Измерение распределения концентрации в аналитической ячейке | 286 |
Факторы, влияющие на скорость седиментации | 292 |
Зависимость s от концентрации | 292 |
Зависимость седиментации от скорости | 295 |
Влияние заряда | 297 |
Стандартные коэффициенты седиментации | 297 |
Факторы, влияющие на значение стандартного коэффициента седиментации | 299 |
Трение: влияние формы | 299 |
Молекулярная масса | 300 |
Метод точного измерения коэффициента седиментации | 301 |
Примеры использования скоростной седиментации | 302 |
Зональное центрифугирование в предварительно подготовленном |
градиенте плотности | 306 |
Определение коэффициента седиментации с помощью зонального |
центрифугирования в предварительно приготовленном градиенте |
плотности | 311 |
Примеры использования зонального центрифугирования в |
препаративной ультрацентрифуге | 313 |
Зональная седиментация в самогенерирующемся градиенте плотности | 317 |
Седиментация ДНК при щелочных значениях pH | 319 |
Определение молекулярной массы методом седиментации-диффузии | 320 |
Измерение молекулярной массы методом седиментационного равновесия | 326 |
Определение молекулярной массы методом приближения к равновесию |
(метод Арчибальда) | 328 |
Седиментационное равновесие в градиенте плотности | 329 |
Измерение молекулярной массы методом седиментационного равновесия в |
градиенте плотности | 331 |
Определение плотности путём седиментации в градиенте плотности | 332 |
Приложение | 344 |
Определение s | 344 |
Список литературы | 346 |
Задачи | 347 |
|
ГЛАВА 12. Парциальный удельный объём и коэффициент диффузии | 350 |
|
Измерение парциального удельного объёма | 350 |
Суммирование v мономерных остатков макромолекулы | 351 |
Методы, основанные на определении плотности | 351 |
Параллельное измерение седиментационного равновесия растворов |
в H2O и D2O | 354 |
Измерение коэффициента диффузии | 355 |
Список литературы | 358 |
Задачи | 359 |
|
ГЛАВА 13. Вязкосгь | 360 |
|
Основы теории вязкости | 360 |
Влияние макромолекул на вязкость раствора | 362 |
Измерение вязкости | 367 |
Капиллярный вискозиметр Оствальда | 367 |
Капиллярный вискозиметр Уббелоде | 368 |
Вискозиметр Куэтта | 369 |
Ротационный вискозиметр Зимма-Крозерса с плавающим ротором и |
его модификация с погруженным ротором | 370 |
Соотношение между характеристической вязкостью и молекулярной массой | 372 |
Примеры использования вискозиметрии | 373 |
Измерение вязкоэластичности растворов ДНК | 378 |
Список литературы | 381 |
Задачи | 381 |
|
ЧАСТЬ V. Спектроскопические методы | 383 |
|
ГЛАВА 14. Абсорбционная спектроскопия | 383 |
|
Общая теория поглощения света молекулами | 383 |
Аппаратура для измерения поглощения в видимом и ультрафиолетовом |
свете | 387 |
Параметры, измеряемые в абсорбционной спектроскопии | 388 |
Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора | 390 |
Применение абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ-областях |
спектра | 393 |
«Репортерные» группы | 406 |
Поглощение поляризованного света | 407 |
Инфракрасная спектроскопия | 408 |
Техника измерения ИК-спектров | 408 |
Информация, содержащаяся в инфракрасных спектрах | 409 |
Применение инфракрасной спектроскопии | 410 |
Спектроскопия комбинационного рассеяния | 411 |
Список литературы | 413 |
Задачи | 413 |
|
ГЛАВА 15. Флуоресцентная спектроскопия | 415 |
|
Общая теория флуоресценции | 415 |
Аппаратура для измерения флуоресценции | 418 |
Изучение белков путём измерения их собственной флуоресценции | 421 |
Информация о конформации и участках связывания в белках, полученная |
путём изучения собственной флуоресценции белков | 423 |
«Внесённая» флуоресценция (метод флуоресцентных меток и зондов) | 427 |
Метод флуоресцентных меток и перенос энергии | 431 |
Эксимеры | 436 |
Поляризация флуоресценции | 437 |
Применение поляризации флуоресценции для изучения белков и |
нуклеиновых кислот | 439 |
Другие применения поляризации флуоресценции 443 |
Поляризационный анализ с возбуждением в импульсном режиме | 444 |
Особые случаи использования флуоресценции в биологии и биохимии | 446 |
Список литературы | 448 |
Задачи | 449 |
|
ГЛАВА 16. Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм | 450 |
|
Общая теория ДОВ и КД | 451 |
Относительная оценка методов ДОВ и КД | 460 |
Аппаратура для измерения ДОВ и КД | 464 |
Интерпретация кривых ДОВ и КД | 466 |
Применение ДОВ и КД для изучения структуры белков и полипептидов | 467 |
Изучение конформационных изменений методом КД | 470 |
Измерение ДОВ и КД в случае полинуклеотидов, нуклеиновых кислот и |
нуклеопротеидов | 472 |
Примеры использования методов ДОВ и КД для изучения структуры |
полинуклеотидов | 475 |
Список литературы | 479 |
Задачи | 479 |
|
ГЛАВА 17. Ядерный магнитный резонанс | 481 |
|
Основы теории ЯМР | 481 |
Химический сдвиг | 485 |
Внутримолекулярное экранирование | 487 |
Парамагнитные эффекты | 488 |
Межмолекулярные эффекты | 488 |
Химический обмен | 489 |
Спин-спиновое взаимодействие | 490 |
Процессы релаксации | 492 |
Аппаратура для измерения ЯМР | 493 |
Данные, получаемые из спектров ЯМР | 494 |
Технические проблемы ЯМР и их решение | 496 |
Отнесение линий для белков и полинуклеотидов | 498 |
Определение химической структуры малых молекул | 500 |
Использование ЯМР для изучения структуры белка | 500 |
Использование ЯМР для изучения структуры полинуклеотидов | 510 |
Введение спиновых меток | 511 |
Фурье-спектроскопня ЯМР | 513 |
Использование других ядер (не протонов) | 514 |
Список литературы | 515 |
Задачи | 516 |
|
ЧАСТЬ VI. Разные методы | 517 |
|
ГЛАВА 18. Разные методы | 517 |
|
Гидродинамический сдвиг и деградация ультразвуком | 517 |
Водородный обмен | 521 |
Равновесный диализ | 523 |
Гибридизация одноцепочечных полинуклеотидов | 525 |
Обнаружение гибридизации с помощью равновесного центрифугирования |
в растворе хлорида цезия | 527 |
Гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах | 527 |
Примеры использования гибридизации | 529 |
Концентрирование растворов макромолекул | 531 |
Высаливание с помощью сульфата аммония | 531 |
Упаривание на роторном испарителе | 532 |
Лиофилизация | 533 |
Диализ под давлением | 533 |
Обратный диализ | 533 |
Мембраны из полых волокон | 534 |
Разделение путём распределения между растворами декстрана и |
полиэтиленгликоля | 535 |
Двойное лучепреломление в потоке | 536 |
Список литературы | 538 |
Задачи | 538 |
|
Словарь терминов | 540 |
|
Ответы к задачам | 545 |
|
Глава 1 | 545 |
Глава 2 | 546 |
Глава 3 | 547 |
Глава 5 | 548 |
Глава 6 | 549 |
Глава 7 | 551 |
Глава 8 | 551 |
Глава 9 | 552 |
Глава 10 | 553 |
Глава 11 | 553 |
Глава 12 | 556 |
Глава 13 | 556 |
Глава 14 | 557 |
Глава 15 | 558 |
Глава 16 | 559 |
Глава 17 | 560 |
Глава 18 | 561 |