Часть первая |
ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ |
|
Введение | 3 |
|
Глава 1 |
Сущность метода | 4 |
Миграция белков в градиенте рН | 5 |
Амфолиты для ИЭФ | 7 |
Создание градиента рН | 9 |
Проблема электропроводности | 11 |
Свойства продажных амфолитов | 13 |
Опасность образования слоя чистой воды | 15 |
Разрешающая способность. Выбор диапазона рН | 15 |
Физико-химические особенности амфолитов | 18 |
Эндосмос | 19 |
|
Глава 2 |
Аналитические варианты ИЭФ | 20 |
ИЭФ в горизонтальных пластинах ПААГ | 20 |
ПААГ для ИЭФ | 20 |
Использование мочевины и детергентов | 24 |
Подготовка пластин и прибора | 26 |
Внесение препарата | 29 |
Электрический режим и время ИЭФ | 31 |
Измерение рН | 33 |
Окрашивание белковых зон | 34 |
ИЭФ в трубках ПААГ | 38 |
ИЭФ в горизонтальных пластинах агарозы | 42 |
|
Глава 3 |
Двумерное фракционирование белков | 45 |
Метод О'Фаррелла | 45 |
Модификации метода О'Фаррелла | 48 |
Электрофорез в формирующемся градиенте рН | 53 |
Расшифровка картин двумерного фракционирования белков по методу О'Фаррелла | 56 |
Использование ИЭФ во втором направлении | 58 |
Электрофорез белков перпендикулярно градиенту рН | 60 |
|
Глава 4 |
Препаративные варианты ИЭФ | 60 |
ИЭФ в слое гранулированного геля | 60 |
Приготовление рабочего слоя геля | 61 |
Внесение препарата | 63 |
Электрический режим ИЭФ | 63 |
Обнаружение и элюция белков | 64 |
ИЭФ в градиенте плотности раствора сахарозы | 67 |
Конструкция колонки | 67 |
Заполнение колонки | 68 |
Внесение препарата | 68 |
Рабочий режим ИЭФ | 69 |
Опорожнение колонки | 70 |
Специфические проблемы | 70 |
Выбор полярности электродов | 70 |
Опасность выпадения осадков | 71 |
Проблема растворимости | 72 |
Максимальная загрузка | 73 |
Получение амфолитов для узких диапазонов рН | 73 |
Колонки фирмы «ISCO» | 74 |
|
Глава 5 |
Изотахофорез | 75 |
Литература | 79 |
|
Часть вторая |
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ |
|
Введение | 81 |
|
Глава 1 |
Основы иммунохимии | 82 |
Защитный аппарат организма высших животных | 82 |
Компоненты крови | 82 |
Фагоцитоз, комплемент и цитоинтоксикация | 84 |
Лейкоциты | 86 |
Антитела | 89 |
Лимфатическая система и селезёнка | 90 |
Затухание иммунного ответа | 93 |
Динамика иммунизации | 93 |
Создание иммунологического арсенала | 94 |
Структура иммуноглобулинов | 95 |
Общий план структуры. Классы иммуноглобулинов | 95 |
Области связывания антигенов | 99 |
Неоднозначность иммунного ответа | 101 |
Синтез и сборка молекул иммуноглобулинов | 103 |
Клетки миеломы и гибридомы | 104 |
Получение иммунной сыворотки и очистка антител | 105 |
Иммунизация кролика | 105 |
Приготовление антисыворотки | 107 |
Очистка иммуноглобулина типа IgG | 107 |
Иммуносорбенты для очистки антител | 109 |
Получение моноклональных антител с помощью гибридом | 113 |
Продажные препараты антител | 116 |
Обнаружение и оценка концентрации антител | 117 |
Кольцевой тест | 118 |
Определение соотношения эквивалентности | 119 |
Гемагглютинация и гемолиз | 121 |
Реакция связывания комплемента | 121 |
Метод Ухтерлони | 124 |
|
Глава 2 |
Использование иммунологических методов для обнаружения белковых зон после обычного электрофореза и ИЭФ | 127 |
Иммунохимическое обнаружение антигенов в самом геле | 127 |
Получение иммунных «реплик» | 128 |
Агарозная реплика | 129 |
Реплика на диазобумаге | 129 |
Реплика на нитроцеллюлозном фильтре | 133 |
|
Глава 3 |
Иммуноэлектрофорез по Грабар и Уильямс | 134 |
|
Глава 4 |
Электроиммунный анализ по Лореллу | 139 |
|
Глава 5 |
Перекрёстный иммуноэлектрофорез | 144 |
Метод Кларка и Фримена | 144 |
Тандемный перекрёстный иммуноэлектрофорез | 147 |
Различные варианты разделения в первом направлении | 149 |
Метод наложения полосы ПААГ на гель агарозы | 150 |
Введение промежуточного геля | 151 |
Метод «слившихся ракет» | 152 |
Литература | 154 |
|
Часть третья |
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ИЗОТОПОВ |
|
Введение | 155 |
|
Глава 1 |
Изотопы, сцинтилляторы и сцинтилляционные счётчики радиоактивности | 157 |
Радиоактивные изотопы | 157 |
Избыток нейтронов | 158 |
Недостаток нейтронов | 161 |
Скорость радиоактивного распада | 163 |
Суммарная радиоактивность препарата | 163 |
Удельная радиоактивность (УА) | 164 |
Радиоактивные изотопы без носителя | 165 |
Сцинтилляторы | 166 |
Жидкие сцинтилляторы | 167 |
Спектр интенсивностей световых импульсов | 170 |
Эффективность счёта радиоактивности | 170 |
Тушение сцинтилляции | 171 |
Регистрация γ-излучения. Твёрдые сцинтилляторы | 172 |
Принципы устройства жидкостного сцинтилляционного счётчика | 174 |
Фотоумножитель | 174 |
Линейные и логарифмические усилители | 175 |
Ограничение амплитуд импульсов. «Пороги» | 177 |
«Шум» прибора | 179 |
Схема совпадений | 180 |
Счётные устройства | 181 |
Точность счёта | 182 |
Хемолюминесценция | 183 |
Фотолюминесценция | 184 |
Флаконы для жидкостных счётчиков | 184 |
Черенковское излучение | 185 |
γ-Счетчики с твёрдым сцинтиллятором | 187 |
Регулирование (настройка) жидкостного сцинтилляционного счётчика | 188 |
Настройка одного канала для счёта одного изотопа | 189 |
Настройка двух каналов для счёта двух разных изотопов | 191 |
Учёт тушения при счёте одного изотопа | 193 |
Учёт тушения при счёте двойной метки | 198 |
Настройка двух каналов для регистрации двойной метки (3Н и 14С) |
в счётчике с линейными усилителями | 201 |
Счёт двойной метки (3Н и 125I) в жидкостном сцинтилляционном |
счётчике | 202 |
|
Глава 2 |
Способы приготовления и регистрации радиоактивных препаратов | 203 |
Препараты в виде водных растворов | 203 |
Сцинтилляторы на основе диоксана | 203 |
Сцинтилляторы на основе толуола и ксилола | 206 |
Некоторые дополнительные замечания | 209 |
Солюбилизация биологических препаратов | 210 |
Счёт радиоактивности на фильтрах | 213 |
Подготовка препаратов к счёту | 213 |
Эффективность счёта. Выход радиоактивности | 217 |
Счёт радиоактивности порошков | 220 |
Счёт радиоактивности после ТСХ и электрофореза в геле | 220 |
Растворение ПААГ в H2O2 | 221 |
Растворение ПААГ без H2O2 с помощью солюбилизаторов | 221 |
Элюция белков и нуклеиновых кислот из геля | 222 |
Авторадиография | 223 |
Непрямая авторадиография | 226 |
Флюорография | 227 |
Количественное определение радиоактивности | 232 |
Регистрация двойной метки (3Н и 14С) в ПААГ | 232 |
Сканирование пластинок торцевыми счётчиками | 233 |
Регистрация радиоактивности в протекающей жидкости | 235 |
|
Глава 3 |
Введение радиоактивной метки в белки | 236 |
Иодирование с помощью Хлорамина Т | 236 |
Иодирование с помощью H2O2 и лактопероксидазы | 239 |
Присоединение специальных иодированных реагентов | 241 |
Иодирование за счёт Na125I в присутствии ICl | 244 |
Введение 14C и 3H | 245 |
Ферментативные методы | 249 |
|
Глава 4 |
Введение радиоактивной метки в нуклеиновые кислоты | 250 |
Химические реакции | 250 |
Метилирование за счёт меченого диметилсульфата | 250 |
Включение 3H из тритиевой воды с помощью метабисульфита натрия | 250 |
Медленный изотопный обмен водорода | 251 |
Введение 3H на З'-конец олигорибонуклеотида (метод Рандерата) | 251 |
Комплекс денатурированной ДНК с меченой N-метоксиаминокислотой | 253 |
Иодирование нуклеиновых кислот | 253 |
Ферментативные реакции | 254 |
Т4-полинуклеотидкиназа | 255 |
Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза | 256 |
Т4-РНК-лигаза | 257 |
ДНК-полимераза I из Е.coli (фермент Корнберга) | 258 |
|
Глава 5 |
Введение радиоактивной метки в белки и нуклеиновые кислоты in vivo | 261 |
Высшие животные | 262 |
Культуры клеток высших организмов | 263 |
Микроорганизмы | 265 |
|
Глава 6 |
Определение концентрации веществ методом изотопного разбавления | 266 |
|
Глава 7 |
Радиоиммунные методы | 269 |
Иммунопреципитация и сорбция из раствора | 270 |
Система двух антител | 270 |
Использование Staphylococcus aureus и белка А, закреплённого на |
сефарозе | 275 |
Радиоактивно меченные антитела | 277 |
Радиоактивно меченный белок А | 278 |
Конкурентные радиоиммунные методы (КРИМ) | 279 |
КРИМ с преципитацией иммунного комплекса | 281 |
КРИМ с фильтрованием | 285 |
Твердофазный КРИМ | 286 |
Сканирование колоний микроорганизмов | 292 |
Ферментативно-иммунные методы | 293 |
Некоторые дополнительные замечания об использовании радиоактивных изотопов | 295 |
|
Литература | 297 |